Les kits d’enrichissement de la GTPase Thermo Scientific Pierce utilisent des sondes GTP ActivX™ pour marquer de manière covalente le site actif des GTPases et les sous-unités GTPase des récepteurs couplés aux protéines G permettant leur enrichissement sélectif à l’aide du marquage de la desthiobiotine.
Les sondes Desthiobiotine-GTP ActivX™ contiennent de la biotine modifiée fixée au nucléotide par une liaison acyle-phosphate labile. Les sondes d’enrichissement de site actif ActivX sont avantageuses pour déterminer les teneurs en enzymes actives grâce à l’utilisation de sondes à marquage analogique afin de permettre le profilage des enzymes actives et inactives. Les sondes ActivX enrichissent de manière sélective uniquement les enzymes qui sont fonctionnellement actives et biologiquement pertinentes au moment du marquage. Grâce à l’enrichissement sélectif, on peut identifier et profiler les classes d’enzymes cibles dans les échantillons ou évaluer la spécificité et l’affinité des inhibiteurs enzymatiques. Après l’élimination des nucléotides GTP ou GDP des enzymes, la sonde desthiobiotine-GTP peut être utilisée pour modifier de façon covalente les résidus de lysine conservés sur le site de liaison des nucléotides GTPase. La pompe Desthiobiotin-GTP peut enrichir, identifier et profiler de façon sélective les classes d’enzymes cibles dans les échantillons. La pré-incubation d’échantillons avec des inhibiteurs de petites molécules qui entrent en concurrence avec des sondes de site actif peut être utilisée pour déterminer l’affinité de liaison des inhibiteurs et la spécificité cible. La sonde Desthiobiotine-GTP ActivX marque de façon covalente le site actif des sous-unités GTPases et GTPase des récepteurs couplés aux protéines G. Applications de la sonde Desthiobiotin-GTP ActivX : • Enrichissement étendu des protéines liant le GTP à partir de tissus, cellules et protéomes sous-cellulaires• Enrichissement des enzymes basé sur la fonction• Profilage de dizaines à centaines de cibles d’inhibiteursL’évaluation du marquage du site actif avec des sondes de desthiobiotine peut être réalisée par transfert Western ou spectrométrie de masse (SM). Pour le flux de travaux de transfert Western, les protéines marquées à la desthiobiotine sont enrichies pour l’analyse SDS-PAGE et la détection ultérieure avec des anticorps spécifiques. Pour le flux de travail MS, les protéines marquées à la desthiobiotine sont réduites, alkylées et enzymatiquement digérées en peptides. Seuls les peptides marqués à la desthiobiotine et sur site actif sont enrichis pour analyse par LC-MS/MS. Les deux flux de travaux peuvent être utilisés pour déterminer la liaison de cibles d’inhibiteurs, mais seul le flux de travaux SM peut identifier les effets sur cible et hors cible d’inhibiteurs globaux. Ces produits sont soumis à une licence d’utilisation de marquage limitée.
Caractéristiques techniques
| Marque | Thermo Scientific |
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| Réf. B-LABO | BL-RE-127746 |
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| Réf. fabricant | 11852134 |
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| Contenu et stockage | Conserver à –80°C |
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| Doser | Test d’analyse quantitative des protéines |
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| Méthode de détection | Chimiluminescence, spectrométrie de masse, transfert Western |
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| Type de substrat | Substrat GTPase |
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| Gamme de produits | ActivX™ |
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| Quantité | 16 x 12,9 μg |
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| À utiliser avec (application) | Extraction |
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| Cible | Kinases (multiples), phosphodiestérases, ATPases, GTPases, phosphatases |
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| Type | Sonde nucléotide marquée |
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| Marqueur ou colorant | Biotine et autres haptènes |
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| Format | Tube, colonne de centrifugation |
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