L’expression du baculovirus Bac-to-Bac™ est une méthode efficace pour produire du baculovirus pour l’expression de protéines de haut niveau dans les cellules d’insectes. Elle repose sur la génération de virus recombinant par transposition spécifique au site dans l’E. coli (DH10Bac™) plutôt que sur la recombinaison homologue dans des cellules d’insectes. Le nouveau vecteur pFastBac™ HBM TOPO™ permet l’expression de protéines sécrétées car il possède le signal de sécrétion de la mélittine d’abeille (HBM). Le nouveau vecteur doit être fortement considéré pour l’expression des glycoprotéines. Les glycoprotéines ne peuvent pas être glycosylées en l’absence de tout signal de sécrétion. Contrairement aux glycoprotéines sécrétées par les cellules de mammifères, les glycoprotéines sécrétées par le baculovirus peuvent facilement être déglycosylées in vitro.
Points forts
C’est une caractéristique très importante pour cristalliser les protéines !
Le vecteur pFastBac™ HBM TOPO™ possède également une extrémité C-terminale His-Tag avec un signal de clivage TEV pour faciliter la purification des protéines de fusion histidine sur des résines chélatrices au nickel (Système de purification PROBOND™) et des protéines natives à l’aide de la protéase AcTev™.
Le vecteur utilise le promoteur de polyédrine puissant pour générer des niveaux élevés d’expression dans diverses lignées cellulaires d’insectes, telles que les cellules Sf9, Sf9 Mimic™, Sf21 et les cellules High Five™ dans les milieux Sf-900 II & Sf-900™ III de Gibco.
Caractéristiques techniques
| Marque | Invitrogen |
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| Réf. B-LABO | BL-RE-127749 |
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| Réf. fabricant | 10778585 |
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| Type | Système d’expression sécrétée |
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| Méthode de clonage | Blunt TOPO™ |
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| Marqueur de protéine | Tag His (6x) |
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| Quantité | 20 réactions |
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| Contenu et stockage | <b>Bac-to-Bac HBM TOPO Secreted Expression System:</b><br>• Vector kit for 20 TOPO cloning reactions, store at -20°C<br> –pFastBac/HBM-TOPO Vector containing C-terminal TEV cleavage site and His-tag<br> –pFastBac 1-Gus control plasmid (control expression vector)<br> –Other kit reagents: 10X PCR, dNTP mix, Salt solution, sterile water, control PCR template, polyhedrin forward primer, SV40 pA reverse primer<br>• One Shot Mach1-T1R Chemically Competent <i>E. coli</i> for 20 reactions (20 x 50 μL), store at -80°C<br>• MAX Efficiency DH10Bac Competent <i>E. coli</i> for 20 reactions (4 kits with 5 x 0.1 mL each), store at -80°C<br>• ExpiFectamine Sf Transfection Reagent (1 mL), store at 4°C, do not freeze<br><br> |
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| Agent de sélection (eucaryotique) | Néant |
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| Mécanisme d’expression | Expression à base de cellules |
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| Système d’expression | Baculovirus |
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| Gamme de produits | Bac-to-Bac™, TOPO™ |
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| Accélérateur | Polyédrine |
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