Maléimide Alexa Fluor™ 633 C5
Alexa Fluor™ 633 est un colorant fluorescent rouge vif, avec un niveau d’excitation parfaitement adapté à la ligne laser de 633 nm. Utilisé pour une génération de signal stable en imagerie et en cytométrie de flux, le colorant Alexa Fluor™ 633 est hydrosoluble et insensible au pH de pH 4 à pH 10. En plus des formulations de colorants réactifs, nous proposons le colorant Alexa Fluor™ 633 conjugué à divers anticorps, peptides, protéines, traceurs et substrats d’amplification optimisés pour le marquage et la détection cellulaires (
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).
Le dérivé de maléimide Alexa Fluor™ 633 est l’outil le plus utilisé pour conjuguer le colorant à un groupe thiol sur une protéine, un oligonucléotide thiophosphate ou un ligand de faible poids moléculaire. Les conjugués Alexa Fluor™ 633 résultants présentent une fluorescence plus lumineuse et une photostabilité plus élevée que les conjugués d’autres fluorophores similaires sur le plan spectral.
colorant Alexa Fluor™ 633
maléimide
groupes thiol sur protéines et ligands, oligonucléotide thiophosphates
622/640 nm
143 000 cm-1M-1
∼ 1300
La protéine doit être dissoute à une concentration de 50 à 100 μM dans un tampon approprié (10 à 100 mM phosphate, Tris ou HEPES), pH 7,0 à 7,5. Dans cette plage de pH, les groupes thiols de la protéine sont suffisamment nucléophiles pour réagir presque exclusivement avec le réactif en présence des groupes amines de la protéine, plus nombreux, qui sont protonés et relativement non réactifs. Nous recommandons de réduire tous les ponts disulfures à ce stade, en utilisant un agent réducteur en excès molaire (10X), comme DTT ou TCEP. L’excès de DTT doit être retiré par dialyse et la modification subséquente du groupe thiol doit être effectuée en l’absence d’oxygène pour prévenir la reformation des ponts disulfures ; ces précautions ne sont pas nécessaires lorsque le TCEP est utilisé avant la conjugaison du maléimide.
Le maléimide Alexa Fluor™ est généralement dissous dans du diméthylsulfoxyde anhydre (DMSO) de haute qualité à une concentration de 1 à 10 mM immédiatement avant l’utilisation, et les solutions mères doivent être protégées de la lumière autant que possible. Généralement, cette solution de réserve est ajoutée à la solution de protéines au goutte à goutte, en agitant, pour produire environ 10 à 20 moles de réactif par mole de protéine ; la réaction se déroule à température ambiante pendant 2 heures ou à 4°C la nuit, à l’abri de la lumière. Tout réactif qui n’a pas réagi avec le groupe thiol peut être consommé en ajoutant un excès de glutathion, mercaptoéthanol, ou d’autres molécules solubles de faible poids moléculaire dotées d’une fonction thiol.
Les anticorps marqués sont typiquement séparés du colorant Alexa Fluor™ libre à l’aide d’une colonne de filtration sur gel, comme la colonne Sephadex™ G-25, la colonne BioGel™ P-30 ou une colonne équivalente. Pour des protéines beaucoup plus grandes ou plus petites, sélectionnez un milieu de filtration sur gel ayant un seuil de poids moléculaire approprié ou purifiez par dialyse. Nous proposons plusieurs kits de purification optimisés pour différentes quantités de conjugués d’anticorps :
kit de purification de conjugués d’anticorps pour 0,5 à 1 mg (
| Marque | Molecular Probes |
|---|---|
| Réf. B-LABO | BL-RE-129751 |
| Réf. fabricant | 10154052 |
| Quantité | 1 mg |
| Type de produit | Colorant |
| Contenu et stockage | Stocker au congélateur (-5 à -30°C) à l’abri de la lumière. |
| Réactivité chimique | Thiol |
| Conditions d’expédition | Température ambiante |
| Groupement de réactifs | Maléimide |
| Marqueur ou colorant | Alexa Fluor™ 633 |
| Type d’étiquette | Colorants Alexa Fluor |
| Gamme de produits | Alexa Fluor™ |
| Émission | 640 nm |
| Excitation | 622 nm |
