Les kits d’enrichissement en kinases Thermo Scientific™ Pierce utilisent les sondes d’ATP ou d’ADP ActivX™ pour marquer de façon covalente le site actif des ATPases, y compris les chaperons et les enzymes métaboliques, afin de permettre leur enrichissement sélectif à l’aide d’un marqueur de la desthiobiotine.
Les sondes Desthiobiotine-ATP ou ADP ActivX sont des dérivés de nucléotides qui modifient de façon covalente le site actif des enzymes avec des résidus de lysine conservés sur le site de liaison des nucléotides. La structure de ces sondes se compose d’une biotine modifiée (desthiobiotine) reliée au nucléotide par une liaison acyl-phosphate labile. La desthiobiotine est un analogue de la biotine qui se lie moins étroitement aux protéines de liaison à la biotine, ce qui entraîne une liaison facilement inversée par le déplacement de la biotine, un pH faible ou une dénaturation thermique.Les sondes d’enrichissement de site actif ActivX sont avantageuses pour déterminer les teneurs en enzymes actives à l’aide de sondes à marquage analogique afin de permettre le profilage des enzymes actives et inactives. Les sondes ATP et ADP ActivX marquent de manière covalente le site actif des ATPases, y compris les chaperons et les enzymes métaboliques, pour permettre leur enrichissement sélectif à l’aide d’un marqueur de desthiobiotine.Les sondes Desthiobiotine-ATP ou ADP peuvent être utilisées pour enrichir, identifier et profiler de façon sélective les classes d’enzymes cibles ou évaluer la spécificité des inhibiteurs enzymatiques. Étant donné que de nombreux ATPases et d’autres protéines liant les nucléotides permettent de se lier aux nucléotides ou aux inhibiteurs même lorsqu’ils sont inactifs sur le plan enzymatique, les sondes de desthiobiotine permettent d’établir le profil des enzymes actives et inactives d’un échantillon complexe. La préincubation des échantillons avec des inhibiteurs de petites molécules qui rivalisent pour les sites actifs peut être utilisée pour déterminer l’affinité de liaison des inhibiteurs. Les sondes nucléotidiques du site actif peuvent également être utilisées pour identifier les effets hors cible des inhibiteurs. Grâce à l’enrichissement sélectif, on peut identifier et profiler les classes d’enzymes cibles dans les échantillons ou évaluer la spécificité et l’affinité des inhibiteurs enzymatiques.Applications des sondes ATP et ADP ActivX :• Profilez des affinités de liaison des petites molécules et de l’inhibition du site actif d’une manière dose-dépendante• Identifiez des dizaines à centaines d’effets sur cible et hors cible d’inhibiteurs à partir de tissus, de cellules et de protéomes infracellulaires• Enrichissez des enzymes sur la base de la fonctionL’évaluation du marquage du site actif avec les sondes de desthiobiotine peut être réalisée par transfert Western ou par spectrométrie de masse (SM). Pour le flux de travaux de transfert Western, les protéines marquées à la desthiobiotine sont enrichies pour l’analyse SDS-PAGE et la détection ultérieure avec des anticorps spécifiques. Pour le flux de travail MS, les protéines marquées à la desthiobiotine sont réduites, alkylées et enzymatiquement digérées en peptides. Seuls les peptides marqués à la desthiobiotine et sur site actif sont enrichis pour analyse par LC-MS/MS. Les deux flux de travaux peuvent être utilisés pour déterminer la liaison de cibles d’inhibiteurs, mais seul le flux de travail MS peut identifier les effets sur cible et hors cible d’inhibiteurs globaux.Ces produits sont soumis à une licence d’utilisation limitée.
Caractéristiques techniques
| Marque | Thermo Scientific |
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| Réf. B-LABO | BL-RE-151847 |
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| Réf. fabricant | 11822134 |
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| Formule | Desthiobiotine-ATP, poids moléculaire 1259 |
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| Contenu et stockage | À la réception, conserver à –80°C. |
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| Doser | Test d’analyse quantitative des protéines |
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| Méthode de détection | Chimiluminescence, spectrométrie de masse, transfert Western |
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| Type de substrat | Substrat kinase |
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| Gamme de produits | ActivX™ |
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| Quantité | 16 x 12,6 μg |
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| À utiliser avec (application) | Extraction |
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| Cible | Kinases (multiples), phosphodiestérases, ATPases, GTPases, phosphatases |
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| Type | Sonde nucléotide marquée |
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| Marqueur ou colorant | Biotine et autres haptènes |
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| Format | Tube, colonne de centrifugation |
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