Dosage optimisé et rationalisé destiné à l’enrichissement des complexes protéiques ou de la chromatine et à la récupération de l’ADN à l’aide d’une technique de capture par microbille magnétique.
Contenu et stockage
Module 1 (expédié sur de la glace humide, stocker à 4°C) : • 2 × 1 ml glycine (1,25 M) • 250 µl Dynabeads™ Protéine A/G (ne pas congeler) • 1,4 ml tampon de réticulation inverse • 500 µl microbilles magnétiques de purification d’ADN (ne pas congeler) • 1,4 ml tampon de purification d’ADN • 200 µl protéinase K (20 mg/ml)
Module 2 (expédié sur glace humide, stocker à 4°C) : • Tampon 1 IP de 10 ml • Tampon 2 IP de 7,5 ml • Tampon de lavage ADN de 8 ml • Tampon d’élution ADN 7,2 ml
Module 3 (expédié sur glace sèche, stocker à -20°C) : • Inhibiteurs de protéase 100 µl (200X) • Module IgG souris 15 µl (1 µg/µl) • IgG lapin 15µ l (1 µg/µl)
Module (expédié sur glace sèche, stocker à -20°C) : • Tampon de dilution de 8 ml •, tampon de lyse de 3,
L’ADN ainsi isolé peut servir aux analyses en aval selon des méthodes comme les dosages par PCR ou qPCR ou le séquençage d’ADN en parallèle à grande échelle. L’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) est une technique puissante pour étudier l’association de certaines protéines avec des régions spécifiques du génome. Ces protéines se liant à des séquences spécifiques de l’ADN joueraient un rôle dans les processus cellulaires comme la réplication, la recombinaison, la réparation et la ségrégation de l’ADN, la stabilité chromosomique, la progression du cycle cellulaire et l’extinction (“silencing”) épigénétique. Au cours d’un dosage ChIP standard, le traitement au formaldéhyde fixe la cellule puis la chromatine est cisaillée et immunoprécipitée par un anticorps très spécifique. Puis l’ADN est analysé pour identifier les régions génomiques où les protéines associées à la chromatine se fixent in vivo. Au cours de l’utilisation du système MAGnify, les cellules ou les tissus sont traités avec du formaldéhyde pour générer une réticulation protéine-protéine et protéine-ADN entre des molécules proches au sein de la chromatine. Les cellules sont ensuite lysées et la chromatine est libérée du noyau puis irradiée par ultrasons pour être cisaillée et obtenir des fragments moyens d’ADN de 200 à 500 bp, qui seront analysés par PCR quantitative en temps réel (qPCR), ou des fragments de 100 à 300 bp analysés par séquençage d’ADN en parallèle à grande échelle. La protéine réticulée d’intérêt est immunoprécipitée et isolée en utilisant un anticorps pour ChIP spécifique, conjugué à la protéine A/G Dynabeads™. La réticulation avec le formaldéhyde est inversée par traitement thermique et l’ADN associé à cette protéine est purifié. L’ADN est alors prêt pour des analyses en aval : PCR en point final ou quantitative (qPCR), analyses de l’ensemble du génome par puces “promoter-tiling arrays” ou séquençage de nouvelle génération. Lors d’une analyse par PCR/qPCR, les amorces sont élaborées pour couvrir la séquence d’ADN d’intérêt souhaitée et les données recueillies permettent de savoir si la protéine d’intérêt est associée in vivo à cette région d’ADN.
Caractéristiques principales
Sensible : obtient des résultats avec des quantités d’échantillons plus faibles que celles requises avec les flux de travaux ChIP standard
Rapide : le protocole peut être complété en une seule journée, par rapport aux 2 à 3 jours pour le dosage ChIP standard
Caractéristiques techniques
Marque
Invitrogen
Réf. B-LABO
BL-RE-151852
Réf. fabricant
10481975
Contenu et stockage
<b>Module 1 (expédié sur de la glace humide, stocker à 4°C) :</b><br>• 2 × 1 ml glycine (1,25 M)<br>• 250 µl Dynabeads™ Protéine A/G (ne pas congeler)<br>• 1,4 ml tampon de réticulation inverse<br>• 500 µl microbilles magnétiques de purification d’ADN (ne pas congeler)<br>• 1,4 ml tampon de purification d’ADN<br>• 200 µl protéinase K (20 mg/ml)<br><br><b>Module 2 (expédié sur glace humide, stocker à 4°C) :</b><br>• Tampon 1 IP de 10 ml<br>• Tampon 2 IP de 7,5 ml<br>• Tampon de lavage ADN de 8 ml<br>• Tampon d’élution ADN 7,2 ml<br><br><b>Module 3 (expédié sur glace sèche, stocker à -20°C) :</b><br>• Inhibiteurs de protéase 100 µl (200X)<br>• Module IgG souris 15 µl (1 µg/µl)<br>• IgG lapin 15µ l (1 µg/µl)<br><br><b>Module (expédié sur glace sèche, stocker à -20°C) :</b><br>• Tampon de dilution de 8 ml<br>•, tampon de lyse de 3,
