Le kit d’activité d’histone déméthylase, à usage de recherche uniquement, est un test d’activité fluorescent conçu pour la quantification et la détection de l’activité de l’histone déméthylase de la déméthylase 1 (LSD1) spécifique à la lysine et des déméthylases de type Jumonji.Ce kit comprend une ou plusieurs plaques noires à 96 puits, des tampons de dosage LSD1/JMJD2A, un étalon de formaldéhyde et d’autres composants pour effectuer le dosage. Ce kit ne contient pas d’échantillons d’enzymes de déméthylase. L’utilisateur doit fournir une source de déméthylase de type LSD1 ou Jumonji, ainsi que tous les cofacteurs, substrats enzymatiques, inhibiteurs et/ou activateurs. Ce kit nécessite l’utilisation d’un lecteur de microplaques à 96 puits par fluorescence capable de lire l’émission fluorescente à 510 nm, avec excitation à 450 nm.Caractéristiques de performance• Type de dosage : kit d’activité par fluorescence• Types d’échantillons : histone déméthylase 1 (LSD1) spécifique à la lysine et déméthylases de type Jumonji• Plage de la courbe standard : 0,128–0,64 μM pour LSD1, 2,5–10 μM pour JMJD2A• Réactivité : humaineContexteL’histone déméthylase (HDM) catalyse la déméthylation spécifique au site des résidus de méthyllysine dans les histones afin de réguler de façon dynamique la structure de la chromatine, l’expression génétique et éventuellement d’autres fonctions génomiques. Les HDM spécifiques à la lysine ont été découverts pour la première fois en 2004 et figurent actuellement parmi les enzymes productrices de formaldéhyde les plus étudiées. À l’heure actuelle, il existe deux classes connues de HDM : la famille de déméthylase 1 (LSD1) spécifique à la lysine et dépendante de la flavine adénine dinucléotide (FAD) et la famille Jumonji C (JmjC) dépendante du Fe(II). Bien que les HDM LSD1 et JmjC utilisent différents cofacteurs et mécanismes catalytiques, ils produisent tous deux du formaldéhyde comme sous-produit de réaction de déméthylation.Malgré leur importance biologique, les HDM se sont avérés difficiles à doser quantitativement en raison de leur nombre de renouvellement relativement faible, ce qui empêche la compréhension de leurs propriétés cinétiques, leurs spécificités envers des substrat et leurs mécanismes de réaction. Ce dosage a été validé pour l’histone déméthylase 1 (LSD1) spécifique à la lysine et les déméthylases de type Jumonji. Pour les échantillons de HDM présents dans les lysats cellulaires, nous incluons un tampon de lyse cellulaire spécialement formulé, qui a été prouvé ne pas interférer avec la détection du formaldéhyde. Les tampons de lyse cellulaire contenant du SDS et du Triton X-100 inhibent la réaction du signal de formaldéhyde et ne doivent pas être utilisés.Principe du dosageLe kit d’activité d’histone déméthylase sert à mesurer quantitativement l’activité enzymatique des enzymes productrices de formaldéhyde telles que les histones déméthylases. Ce kit est unique, car le produit de ces réactions enzymatiques de déméthylation, le formaldéhyde, est quantifié directement par un produit fluorescent. Aucune séparation ou lavage n’est nécessaire. Le kit a été validé pour les déméthylases histones (HDM) LSD1 et JMJD2A.Le kit contient des tampons optimisés pour les HDMS LSD1 et JMJD2A, un étalon stable pour le formaldéhyde, le réactif de détection du formaldéhyde (FDR) et deux plaques à 96 puits pour détecter le signal fluorescent généré. Le kit permet de mesurer toute réaction enzymatique générant du formaldéhyde. L’utilisateur final devra fournir le système de déméthylase et tous les cofacteurs nécessaires à l’activité, ainsi que tous les inhibiteurs ou activateurs de test. Le kit permet aux utilisateurs finaux de produire de l’activité HDM dans de nombreux systèmes in vivo et in vitro, puis de déterminer l’activité en mesurant la production de formaldéhyde. Pour les études in vitro, la réaction HDM doit être réalisée dans nos tampons fournis en utilisant des conditions de réaction optimisées pour la déméthylation.Suite à la réaction génératrice de formaldéhyde, la réaction peut être arrêtée par l’ajout d’un inhibiteur approprié. Le FDR est ensuite ajouté à tous les puits. Si l’étalonnage du formaldéhyde est nécessaire (à des fins de comparaisons entre laboratoires), il est nécessaire de générer une courbe standard de formaldéhyde à partir de l’étalon fourni. Après une courte incubation à 37°C pendant 30 minutes, le produit fluorescent est lu à 510 nm dans un lecteur de plaques fluorescentes avec une excitation à 450 nm.
Caractéristiques techniques
| Marque | Invitrogen |
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| Réf. B-LABO | BL-RE-090584 |
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| Réf. fabricant | 15690079 |
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| Contenu et stockage | Plaque(s) à 96 puits, standard, réactif de détection, tampon de dosage, substrat et fiche technique spécifique au lot.<br><br>Stocker à –20°C. |
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| Format du kit d’immunoessai | Kit d’activités |
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| À utiliser avec (équipement) | Lecteur de microplaques |
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| Quantité | 2 x 96 tests |
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| Conditions d’expédition | Homologué pour des expéditions sur de la glace carbonique ou mouillée |
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| Kit cible nommé | Déméthylase d’histone |
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