Le kit d’activité de déméthylase P450, à usage de recherche uniquement, est un test d’activité fluorescent conçu pour la quantification et la détection de l’activité de déméthylation P450 dans les microsomes ou les cerosomes hépatiques tels que Cyp P450 3A4, 2B4 et 2D6.Ce kit comprend une ou plusieurs plaques noires à 96 puits, un tampon de dosage, un étalon de formaldéhyde et d’autres composants pour effectuer le dosage. Ce kit ne contient pas les systèmes P450. Les systèmes microsome, cerosome, baculosome ou supersome P450, ou recombinant P450, doivent être fournis par l’utilisateur. Ce kit nécessite l’utilisation d’un lecteur de microplaques à 96 puits par fluorescence capable de lire l’émission fluorescente à 510 nm, avec excitation à 450 nm.Caractéristiques de performance• Type de dosage : kit d’activité par fluorescence• Types d’échantillons : systèmes de déméthylation P450, par exemple microsomes ou cerosomes hépatiques tels que Cyp P450 3A4, 2B4 et 2D6• Plage de la courbe standard : 1,6–20 pmol/100 μL• Réactivité : humaine, ratContexteLes cytochromes P450 (P450s) sont une superfamille d’enzymes contenant de l’hème qui présentent une grande diversité en ce qui concerne la spécificité du substrat et l’activité catalytique. Les P450 utilisent de nombreux composés exogènes et endogènes comme substrats dans les réactions enzymatiques. Ils font généralement partie de réactions de transfert d’électrons multicomposants. La catalyse par les enzymes eucaryotes P450 implique un cycle de réaction en plusieurs étapes qui comprend deux phases dans lesquelles le transfert d’électrons est réalisé à partir d’un partenaire redox. La protéine de diflavine, la NADPH cytochrome P450 réductase, contient à la fois la FAD et la FMN et peut transférer les deux électrons nécessaires au cycle catalytique3. Dans certaines réactions P450, le deuxième électron du cycle de réaction peut également être émis par le cytochrome b5.Les lipides jouent un rôle important dans la reconstitution des activités dépendantes du P450 après purification des protéines6. La plupart des études in vitro pour la reconstitution des activités du P450 utilisent la dilaurylphosphatidylcholine (DLPC) comme composant lipidique. La reconstitution de l’activité enzymatique implique une incubation concentrée de P450, de ses partenaires redox (NADPH et réductase) et de lipides, suivie d’une dilution dans les composants de dosage final.Principe du dosageLe kit d’activité de déméthylase P450 est conçu pour mesurer quantitativement l’activité enzymatique des enzymes productrices de formaldéhyde telles que les cytochromes P450. Ce kit est unique, car le substrat fluorescent n’est pas impliqué dans la réaction multicomposant P450, mais mesure le produit de la déméthylation, le formaldéhyde. Aucune séparation ou lavage n’est nécessaire. Le kit a été validé pour plusieurs systèmes P450 et devrait fonctionner avec tout système biologique produisant du formaldéhyde comme produit de déméthylation.Le kit contient un tampon optimisé pour les flacons lyophilisés P450 du cofacteur NADPH pour la réaction, un étalon stable de formaldéhyde, le réactif de détection du formaldéhyde (FDR) et deux plaques à 96 puits pour la détection du signal fluorescent généré. L’utilisateur final doit fournir le système microsomal, baculosome ou recombinant P450, le système réductase et cytochrome b5 et tous les cofacteurs nécessaires à l’activité, ainsi que tous les médicaments, inhibiteurs ou activateurs candidats à l’essai. La réaction doit être effectuée dans notre tampon fourni ou dans un système de tampon PBS similaire.Suite à la réaction induite par le NADPH P450, la production de formaldéhyde peut être arrêtée par l’ajout d’un inhibiteur approprié ou par la solution d’arrêt d’acide acétique fournie. Le FDR est ensuite ajouté à tous les puits. Si l’étalonnage du formaldéhyde est nécessaire (à des fins de comparaisons entre laboratoires), il est nécessaire de générer une courbe standard de formaldéhyde à partir de l’étalon fourni.Après une courte incubation à 37°C pendant 30 minutes, le produit fluorescent est lu à 510 nm dans un lecteur de plaques fluorescentes avec excitation à 450 nm. L’activité P450 est déterminée sur la base de la production de formaldéhyde.
Caractéristiques techniques
| Marque | Invitrogen |
|---|
| Réf. B-LABO | BL-RE-092262 |
|---|
| Réf. fabricant | 15890903 |
|---|
| Contenu et stockage | Plaque(s) à 96 puits, standard, réactif de détection, tampon de dosage, substrat et fiche technique spécifique au lot.<br><br>Stocker à –20°C. |
|---|
| Format du kit d’immunoessai | Kit d’activités |
|---|
| À utiliser avec (équipement) | Lecteur de microplaques |
|---|
| Quantité | 2 x 96 tests |
|---|
| Conditions d’expédition | Homologué pour des expéditions sur de la glace carbonique ou mouillée |
|---|
| Kit cible nommé | Déméthylation P450 |
|---|
Une question, une configuration particulière ?
Contactez-nous pour un devis.
