L’expression du baculovirus Bac-to-Bac™ est une méthode efficace pour produire du baculovirus pour l’expression de protéines de haut niveau dans les cellules d’insectes. Elle repose sur la génération de virus recombinant par transposition spécifique au site dans l’E. coli (DH10Bac™) plutôt que sur la recombinaison homologue dans des cellules d’insectes. Le nouveau vecteur pFastBac™ HBM TOPO™ permet l’expression de protéines sécrétées car il possède le signal de sécrétion de la mélittine d’abeille (HBM). Le nouveau vecteur doit être fortement considéré pour l’expression des glycoprotéines. Les glycoprotéines ne peuvent pas être glycosylées en l’absence de tout signal de sécrétion. Contrairement aux glycoprotéines sécrétées par les cellules de mammifères, les glycoprotéines sécrétées par le baculovirus peuvent facilement être déglycosylées in vitro.
Points forts
C’est une caractéristique très importante pour cristalliser les protéines !
Le vecteur pFastBac™ HBM TOPO™ possède également une extrémité C-terminale His-Tag avec un signal de clivage TEV pour faciliter la purification des protéines de fusion histidine sur des résines chélatrices au nickel (Système de purification PROBOND™) et des protéines natives à l’aide de la protéase AcTev™.
Le vecteur utilise le promoteur de polyédrine puissant pour générer des niveaux élevés d’expression dans diverses lignées cellulaires d’insectes, telles que les cellules Sf9, Sf9 Mimic™, Sf21 et les cellules High Five™ dans les milieux Sf-900 II & Sf-900™ III de Gibco.
Caractéristiques techniques
| Marque | Invitrogen |
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| Réf. B-LABO | BL-RE-087250 |
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| Réf. fabricant | 10758415 |
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| Lignée cellulaire | High Five™, Sf21, Sf9 |
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| Type de cellule | Cellule d’insectes |
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| Méthode de clonage | Blunt TOPO |
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| Clivage | Site de reconnaissance des protéases TEV |
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| Contenu et stockage | Le kit de clonage Bac-to-Bac™ HBM TOPO™ contient : (Pour plus de détails, voir le manuel)<br>• Kit de vecteur pour 20 réactions de clonage topo<br>• Vecteur pFastBac⁄HBM TOPO™ contenant le clivage TEV d’extrémité C-terminale et le marquage His. <br>• Plasmide de contrôle pFastBac⁄CT-Gus (vecteur d’expression de contrôle)<br>• Autres réactifs fournis : 10x PCR, mélange dNTP, solution saline, eau stérile, modèle PCR de contrôle, amorce sens de polyédrine, amorce antisens SV40 pA<br>• Kit contenant des cellules compétentes (20 réactions) :<br>• E. coli chimiquement compétentes One Shot™ Mach1-T1R<br><br>Kit de vecteur : conserver à -20°C<br>E.coli chimiquement compétentes One Shot™ Mach1-T1R : conserver à -80°C |
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| Format | Kit |
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| Mécanisme d’expression | Expression à base de cellules |
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| Système d’expression | Baculovirus |
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| À utiliser avec (application) | Expression de protéines |
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| Compatibilité à haut débit | Compatible à haut débit, non compatible à haut débit (manuel) |
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| Principales fonctions | Expression sécrétée |
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| Nbre de réactions | 20 réactions |
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| Gamme de produits | Bac-to-Bac™, TOPO™ |
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| Type de produit | Kit de clonage |
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| Accélérateur | Polyédrine |
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| Marqueur de protéine | HBM (mélittine d’abeille), marquage His (6x) |
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| Quantité | 20 réactions |
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| Agent de sélection (eucaryotique) | Néant |
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| Vecteur | pFastBac/HBM-TOPO |
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